干细胞与组织工程

于细胞研究始于20世纪60年代，发展迅速，在1999年12月美国Science杂志公布的年度十大科学成果中名列榜首。2000年再度被Science杂志评为世界十大科学成就之一。目前，干细胞研究几乎涉及所有生命科学和生物医药领域。本文主要就干细胞在组织工程研究中的应用做一综述。     

人子宫内膜细胞原代培养方法的改良

目的 寻求一种简便高效的人子宫内膜上皮细胞和间质细胞分离、纯化与鉴定方法,建立稳定的子宫内膜细胞体外培养体系.方法 简化Ryan等的子宫内膜细胞原代培养方法的取材,分离和培养条件,分离出高纯度的子宫内膜上皮细胞和间质细胞进行体外培养和传代.结果 培养成功的子宫内膜上皮细胞与间质细胞均可稳定传代,体外生长10～50 d,纯度均达90%以上.结论 该方法简便高效,可建立稳定的人子宫内膜细胞体外培养体系.     

小鼠微小RNA miR-22真核表达载体的构建及功能初步研究

目的 从基因组DNA扩增miR-22前体对应的基因组片段并克隆到pIRES2-EGFP,构建miR-22的真核表达载体.方法 利用PCR技术从基因组DNA扩增miR-22前体对应的基因组片段,克隆到质粒pUCm-T,测序正确后构建到真核表达载体pIRES2-EGFP中,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,并进行序列测定.脂质体Lipofectamin 2000法转染Hela细胞后G418筛选获得稳定转染克隆,提取总RNA,通过RT-PCR方法对neo片段进行鉴定,采用Northern blot技术检测miR-22的表达.结果 PCR扩增得到的334 bp片段与预期的miR-22前体对应的基因组片段序列一致;成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/miR-22,测序结果正确.重组质粒转染Hela细胞后,经G418筛选成功获得阳性克隆.Northern blot分析显示miR-22在Hela细胞内高效表达.结论 本实验成功克隆了miR-22的前体对应的基因组片段,构建其真核表达载体,并在Hela细胞内获得高表达,为深入研究微小RNA miR-22的功能奠定了基础.     

微小RNA分子miR-21和miR-22对C2C12细胞成肌分化影响的研究

目的探讨微小RNA（microRNAs）分子miR-21和miR-22对于C2C12细胞体外成肌分化进程的影响。方法以C2C12细胞体外成肌分化为模型，Northern blot检测miR-21和miR-22两个分子在分化过程中的表达变化及组织表达谱，转染DNA／LNA杂合体反义链进行loss-of-fuction功能研究，RT-PCR分析其对分化相关分子的影响。结果成功建立C2C12细胞体外成肌分化模型，2个分子在分化过程中均表达上调，且它们具有各自的组织分布特点；建立了以DNA／LNA杂合体反义链为手段的microRNAs研究的loss-of-fuction平台；与对照组比较，抑制这2个microRNAs对于成肌分化相关的骨骼肌α-肌动蛋白、成肌素和MEF-2D等分子的表达没有影响。结论抑制miR-21和miR-22在C2C12细胞成肌分化过程中的上调不影响其分化，说明这2个分子对于分化的进程影响不大。     

严重烧伤对SRC-3基因敲除小鼠肝脏NF-κB表达及核转位的影响

目的研究烧伤对SRC-3基因敲除小鼠转录因子NF-κB表达及核转位的影响.方法以SRC-3基因敲除小鼠为实验组,以野生型小鼠为对照组,以小鼠15%～20%TBSAⅢ度烧伤为实验模型,观察两组在严重烧伤前、烧伤后1、6、12 h肝脏总蛋白NF-κB、IκB-α表达及核蛋白NF-κB转位情况.结果野生型小鼠致伤后肝脏总蛋白中NF-κB各时相点除伤后6 h有所下降外(P<0.05),其余相差不显著,而SRC-3基因敲除小鼠致伤后肝脏总蛋白中NF-κB有增加的趋势;野生型小鼠致伤后肝脏NF-κB核转位明显增加(P<0.01),6 h达到峰值,而SRC-3基因敲除小鼠致伤后肝脏NF-κB核转位亦有所增加,但明显低于野生型小鼠(P<0.01);野生型小鼠致伤后肝脏总蛋白中IκB-α表达变化不明显(P>0.05),而SRC-3基因敲除小鼠致伤后肝脏总蛋白中IκB-α表达伤后1 h明显下降(P<0.01),之后均高于正常(P<0.01).结论严重创伤后SRC-3基因敲除小鼠NF-κB的表达及核转位与野生型小鼠有明显的差异,SRC-3的缺失可能部分抑制了NF-κB对创伤应激的调控作用.     

长期接触贫铀对大鼠遗传毒性的初步研究

目的研究贫铀植入/摄入3个月后对大鼠的毒性作用.方法观察大鼠精子畸形率,骨髓微核率的改变,睾丸的超微结构和病理形态学改变以及采用显性致死突变试验观察贫铀对大鼠的生殖毒性.结果植入/摄入贫铀后大鼠精子畸形率和微核率均有增加,睾丸超微结构均有不同程度的改变,而病理形态学观察则未见显著影响.植入组大鼠受孕率明显低于对照组.结论贫铀长时间暴露可对大鼠产生生殖毒性损害以及超微结构的损伤.     

烧伤后骨髓巨核细胞被噬现象机制的初步探讨

目的 初步探讨烧伤后骨髓巨核细胞被噬现象的机制.方法 采用光镜、电镜观察30%Ⅲ度烧伤后大鼠骨髓巨核细胞的形态变化,分别分离正常和30%Ⅲ度烧伤大鼠骨髓巨核细胞、中性粒细胞,采用Transwell双室培养法观察骨髓巨核细胞与中性粒细胞的游走关系.结果 30%Ⅲ度烧伤后大鼠骨髓巨核细胞部分细胞的细胞质呈局灶样坏死,部分中性粒细胞进入到巨核细胞的细胞质进行噬食,即巨核细胞被噬现象.扫描电镜显示,烧伤后巨核细胞形态不规则,表面呈现出珊瑚样的窟窿洞,而正常组的巨核细胞呈圆形,表面光滑.分离正常和烧伤后的中性粒细胞、巨核细胞分别进行双室交叉培养,发现烧伤组大鼠骨髓巨核细胞对中性粒细胞有明显的趋化作用,而正常骨髓巨核细胞对中性粒细胞的趋化作用不明显.结论 30%Ⅲ度烧伤后骨髓巨核细胞发生不同程度的损伤,且对中性粒细胞有很强的趋化作用,从而趋化后者进入损伤的巨核细胞,发生被噬现象.     

烧伤小鼠IFIT1表达的初步观察

目的 观察烧伤小鼠干扰素诱导表达蛋白IFIT1的表达变化,初步探究其表达变化的原因.方法 实验小鼠致TBSA 15%Ⅱ度烧伤,1 d及7 d后处死,取肝、肺及脾组织.脂多糖掺入小鼠腹腔巨噬细胞株RAW264.7的培养基中,至终浓度0.1～1.0μg/ml,作用6 h.提取组织及细胞RNA,进行半定量逆转录-聚合酶链式反应,提取组织及细胞裂解上清,进行免疫印迹检测.结果 小鼠肝、肺、脾组织IFIT1的转录在烧伤后1 d升高,伤后7 d恢复至伤前水平;肝、肺、脾IFIT1的蛋白水平在伤后1 d一致升高,伤后7 d仍能检出升高.体外实验,细菌脂多糖显著激活RAW264.7细胞的IF-IT1转录及蛋白表达.结论 烧伤小鼠伤后早期IFIT1表达迅速升高,此变化与同期的内毒素血症引起的细胞应激有关.     

创伤早期伤口液对体外培养真皮多能干细胞增殖迁移特性的影响

目的 探讨真皮多能干细胞在创伤修复启动中的作用.方法 采用前期建立的技术分离、纯化并扩增真皮多能干细胞、真皮成纤维细胞和血管内皮细胞;利用四唑盐比色试验(MTT法)检测不同时间、不同浓度伤口液对上述细胞的影响.在此基础上,观察伤后1 d伤口液对真皮多能干细胞贴壁力和迁移力等与创伤修复密切相关的指标变化.结果 伤后不同时相不同浓度伤口液对真皮多能干细胞增殖均具有显著刺激作用,但以伤后早期的伤口液作用最为明显.成纤维细胞和血管内皮细胞对伤口液反应均显著弱于真皮多能干细胞.伤口液作用后真皮多能干细胞贴壁力和迁移能力较对照组细胞显著增加.结论 真皮多能干细胞是创伤愈合,特别是创伤修复启动过程中的一种重要的间充质干细胞,对其深入研究有望为阐明创伤修复启动分子机制提供依据.     

CXCR4腺病毒表达载体的构建及其在真皮多能干细胞中的表达

目的构建大鼠CXCR4的腺病毒表达载体,并观察其转染真皮多能干细胞(dermal multipotent stem cells,dMSCs)后的表达情况.方法扩增含有CXCR4的全长cDNA,然后亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与pAdEasy-1质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组产生含有CXCR4的骨架质粒(pAdEasy/CXCR4).将验证正确的pAdEasy/CXCR4用Pac Ⅰ酶切后转染293细胞,从而包装出CXCR4的腺病毒表达载体(Adv-CXCR4).用Adv-CXCR4转染dMSCs,并采用RT-PCR、免疫荧光细胞化学和荧光激活细胞分类计数的方法检测其表达情况.结果PCR、酶切和测序结果证明,成功地将CXCR4全长cDNA克隆到骨架质粒中,并包装出腺病毒表达载体.同时,Adv-CXCR4转染dMSCs后可有效地增加dMSCs中CXCR4的表达.结论CXCR4的腺病毒表达载体的成功构建和其在dMSCs中的表达,为研究CXCR4在干细胞移植中的应用奠定基础.